，在化学防治领域，人们关注的重点集中在杀菌剂的作用机制和病原菌的抗药性机制，而往往忽略病原菌在化学防治胁迫压力下的应答反应机制。
在杀菌剂的胁迫压力下，植物病原菌可以通过多种途径减轻杀菌剂的危害，由禾谷镰孢菌侵染导致的小麦赤霉病是我国小麦生产上最具威胁的流行性病害之一。
21世纪以来，受气候条件变化、秸秆还田等因素影响，我国小麦赤霉病的发生频率明显增加，该病害的流行不仅可造成小麦大幅度减产，还可导致脱氧雪腐镰孢菌烯醇等多种毒素污染谷物，严重威胁人类和动物的健康。
琥珀酸脱氢酶类杀菌剂是农业生产上非常重要的一类杀菌剂，该类杀菌剂通过作用于电子传递链上的复合物II影响病原菌的呼吸链电子传递系统，阻碍其能量的代谢，从而抑制病原菌的生长。
氟唑菌酰羟胺是中化集团开发的新一代的SDHIs杀菌剂，该药剂对小麦赤霉病具有优异的防治效果，2020年1月在我国小麦上登记使用。
前期研究表明F.graminearum对该药剂存在中-高等抗性风险，建议生产商将该药剂与其他杀菌剂轮换使用或复配使用。
本研究采用转录组测序技术比较分析F.graminearum分别在SDHIs杀菌剂氟唑菌酰羟胺和苯并烯氟菌唑处理后的基因表达特征，从转录组水平揭示F.graminearum对SDHIs杀菌剂胁迫的应答机制，为开发SDHIs杀菌剂的协同增效药剂提供研究思路。
将菌株PH-1接种到6%绿豆汤培养基，25℃、175r·min-1培养3d后，收集分生孢子，取5mL1×105个·mL-1的分生孢子分别接种到100mLYEPD培养基，25℃、150r·min-1培养12h后，分别加入氟唑菌酰羟胺、苯并烯氟菌唑。
氟唑菌酰羟胺处理样品标记为PH-1-F、苯并烯氟菌唑处理样品标记为PH-1-B。由南京集思慧远生物科技有限公司进行转录组测序及初步数据分析。
采用Trizol法提取样品菌丝总RNA，检测RNA的纯度、浓度、核酸吸收峰，用带有Oligo的磁珠富集真核生物mRNA，加入FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断。
以mRNA为模板合成cDNA，利用AMPureXPbeads纯化cDNA，纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPureXPbeads进行片段大小选择。
最后通过PCR富集得到cDNA文库，使用Qubit2.0进行初步定量，使用Agilent2100对文库的大小进行检测。
库检合格后,不同文库按照目标下机数据量进行pooling，用Nova平台进行测序，测序读长为PE150。
对RawData进行数据过滤，去除其中的接头序列及低质量reads，获得高质量的CleanData，将CleanData与PH-1菌株的基因组进行序列比对，获得MappedData。
基于MappedData，进行插入片段长度检验、随机性检验等测序文库质量评估，根据基因在不同样品的表达量进行差异表达基因分析、GO差异表达基因功能注释、KEGG功能富集等高级分析。
采用聚乙二醇介导的原生质体转化Split-markerPCR片段法对菌株PH-1的FgFAH基因进行敲除。
以菌株PH-1基因组DNA为模板，分别对FgFAH基因上下游侧翼序列进行PCR扩增，将FgFAH基因上下游片段分别一步克隆到PHYG1.4质粒中hyg基因上下游。
以一步克隆获得的阳性质粒为模板，分别扩增包含前半部分hyg的上游目的片段和包含后半部分hyg的下游目的片段，用于原生质体转化。
将菌株PH-1接种至6%绿豆汤培养基中摇培，3d后将收集的孢子用YEPD培养基萌发11h左右，当菌丝萌发至孢子长度的2~3倍时过滤菌丝。
将收集的菌丝加入酶解液中，酶解2h左右镜检并过滤原生质体，利用STCbuffer稀释原生质体至107个·mL-1。
将原生质体悬浮液100μL，30%PEG40μL，上下游目的片段各20μL混合并放置冰上孵育30min，加入1mL30%PEG，室温下再孵育5～10min。
加入10mLRM培养基于以上混合物中倒两个平板，原生质体再生培养12~24h后用含有300μg·mL-1潮霉素B溶液的RM培养基覆盖上层，4~7d内长出转化子，将长出的转化子转移到含有潮霉素B的V8培养基上生长2~3d，转到新的PDA平板中。
将FgFAH基因敲除突变体及亲本菌株PH-1分别接种于含不同浓度的氟唑菌酰羟胺、苯并烯氟菌唑的YBA平板中，以不含杀菌剂的YBA平板做对照，25℃条件下培养4d，观察敏感性差异并用十字交叉法测量菌落直径，计算EC50值。每处理重复三次。
为了揭示F.graminearum受到SDHIs杀菌剂胁迫后基因表达特征的变化，本研究通过转录组分析比较了SDHIs杀菌剂处理前后的差异表达基因，通过FPKM方法计算DEGs。
相比PH-1，PH-1-F样品中有2520个基因差异表达显著，其中1374个基因上调表达，1146个基因下调表达，PH-1-B样品中有3959个基因差异表达显著，其中2090个基因上调表达，1869个基因下调表达。
差异基因韦恩图分析表明：氟唑菌酰羟胺、苯并烯氟菌唑分别处理后的DEGs中，两者共有的上调DEGs有1180个，共有的下调DEGs有937个，分别占所有DEGs的51.7%和45.1%，表明氟唑菌酰羟胺和苯并烯氟菌唑对F.graminearum有相似的作用机制。
GO功能富集分析显示：共同上调的差异基因。
